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产品概述

染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)作为最佳的研究体内DNA与蛋白质相互作用的 方法,它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然 后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋 白质与DNA相互作用的信息。


操作流程

1. 称取新鲜的组织或冰冻的组织,用振动切片机将组织切成1-3mm小块。

2. 转移组织至50ml离心管中,用预冷的PBS清洗3次,去除PBS,加培养液(1640)至9ml。

3. 加入243 μl 37%甲醛,使得甲醛终浓度为1%,室温摇床10min。

4. 终止交联:加1M 甘氨酸1.26ml,使其终浓度为0.125M 室温摇床5min。

5. 吸尽培养基,用预冷的PBS洗两次后,加适量蛋白酶抑制剂(2ml PBS中加入5 µl蛋白酶抑制剂),用玻璃匀浆器将组 织磨碎,形成单细胞悬液,2000rpm,4℃离心5min。

6. 弃上清,加入1ml Buffer A,冰上放置10min,3000-5000rpm离心5min。

7. 弃上清,加入400 Buffer B(每100 Buffer B中含有10 6细胞)重悬后加入5µl 蛋白酶抑制剂。

8. 超声破碎。一般来说,300W超声15s,间隔45s,13次。12000rpm,4℃离心20min。取20µl上清电泳检测,抹带 集中在500-1000bp左右即可。

9. 样品分成三组,每组100µl ,A:实验组 ; B:阳性对照组 ; C:阴性对照组,剩余样品可放置-80℃保存。

10. 在三组样品中分别加入900µl Chip Diluiton Buffer。

11. 准备ProteinA beads,用1ml PBS 清洗三次(3000rpm离心1min)后保存备用,此步可提前准备。

12. 三组样品中各加入60µl ProteinA beads, 4℃颠倒混匀1-2h。

13. 混匀后4℃静置10min,3000rpm离心1min。

14. 取上清,每组样品取20µl 进行 Input实验,-20℃保存。

15. 实验组中加入1-10µg抗体;阳性对照组加入1µg RNA Polymerase II抗体;阴性对照组加入1µl 正常血清IgG,4℃过夜孵育。

16. 三组样品中再加入60µl ProteinA beads, 4℃颠倒混匀1-2h。

17.洗涤ProteinA beads ,依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗步骤为:加入1ml 预冷溶液,在4℃混匀10min,3000rpm离心 1min,除去上清。

a. Low Salt Wash Buffer,1次。

b. High Salt Wash Buffer,1次。

c. LiCl Wash Buffer,1次。

d. TE Buffer,2次。

18. 每管加入100µl Elution Buffer(100 µl10%SDS+100 µl1M NaHCO3+800 µl ddH2O),室温颠转10min后3000rpm离心 1min,收集上清。重复洗脱1次,终体积200µl 。

19. 取出 Input实验样品,室温融化后加入180µl Elution Buffer。

20. 解交联。每管中加入8µl 5M NaCl,混匀,65℃解交联过夜。

21. 解交联结束后,每管加入1µl RNaseA,37℃孵育1h。

22. 每管加入4µl 0.5M EDTA,8µl 1M Tris-HCl(PH=6.5),1µl Proteinase K,45℃孵育2h。

23. DNA片段回收(WLA052a DNA凝胶回收试剂盒)。

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