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产品概述

核蛋白和浆蛋白提取试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从细胞或组织中提取细胞核蛋白和浆蛋白的方法 , 约90min就可以完成细胞核蛋白与浆蛋白的分离。制备的核蛋白和浆蛋白能保持天然活性,且纯度较高 , 可用于Western blot、co-IP、 EMSA(也称gel shift)、footprinting进一步的转录因子活性分析、酶活性测定等后续蛋白质研究。

本试剂盒是通过细胞浆蛋白提取试剂A和B,在低渗透压条件下,使细胞充分膨胀,然后破坏细胞膜,释放出细胞浆蛋白,然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白提取试剂C提取得到细胞核蛋白。


操作流程

1. 室温溶解试剂盒中的三种试剂,溶解后立即放置在冰上。取适量的细胞浆蛋白抽提试剂A和细胞核蛋白抽提试剂 C备用,在使用前数分钟内加入PMSF和DTT,使其终浓度均为1mM。
2. 贴壁细胞:取培养细胞2 x106-2x107个,弃培养液,用预冷的1x PBS洗2-3次,离心10min(1000rpm),弃上清 , 留下细胞沉淀备用。
3. 悬浮细胞:用预冷的1xPBS洗一遍,1000rpm , 离心10min,弃上清,留下细胞沉淀备用。
4. 每20ul沉淀加入200μl添加了PMSF和DTT的细胞浆蛋白抽提试剂A。
5. 最高速剧烈涡旋5s,把细胞沉淀完全悬浮并分散开 , 冰浴10-15min。若没有完全分散开,可适当延长涡旋时间。
6. 加入10μl细胞浆蛋白抽提试剂B,最高速剧烈涡旋5s,冰浴1min。
7. 最高速剧烈涡旋5s,12000rpm , 4 ℃离心5min  , 取上清即为细胞浆蛋白。
8. 对于沉淀,完全吸尽残余的上清,加入50ul添加了PMSF和DTT的细胞核蛋白抽提试剂C。
9. 最高速剧烈涡旋15-30s后放回冰浴中,每隔1-2min再涡旋15-30s,共30min。
10. 12000rpm, 4℃离心10min , 取上清即为细胞核蛋白。
11. 组织 :
(1)取60mg组织 , 尽可能切成非常细小的碎片 , 加入200μl细胞浆蛋白抽提试剂A与10μl细胞浆蛋白抽提试剂B , 并加入PMSF和DTT至其终浓度为1mM , 在玻璃匀浆器内充分匀浆 , 匀浆需在冰浴或4℃进行。
(2)匀浆后把匀浆液转移至预冷的离心管中,冰浴放置15min。
(3)12000rpm,4 ℃离心5min 。把上清转移至一预冷的离心管中,即为抽提到的部分细胞浆蛋白。
(4)对于沉淀,继续按照步骤4-10开始操作 , 即得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白 , 其中细胞浆蛋白可以和步骤11中抽 提到的细胞浆蛋白合并使用。

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