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产品概述

活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。 DCFH-DA本身没有荧光 , 可以自由穿过细胞膜 , 进入细胞内后 , 可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能 通透细胞膜,从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成强绿色荧光物DCF, 其荧光在激发波长502nm,发射波长530nm附近有最大波峰,强度与细胞内活性氧水平成正比。 本试剂盒本底低,灵敏度高,线性范围宽,使用方便;可以测定100-500个样品。


操作流程

装载探针
对于药物处理时间较短(<2h)的细胞或预计ROS效应较弱,可先或同时装载DCFH-DA探针。反之,对于细胞药物 处理时间较长(>6h)的细胞或预计产生ROS效应较强 , 可后装载探针DCFH-DA。
1 . 培养细胞的测定:
( 1)加入荧光探针
①、在暗室中加入 DCFH-DA 于培养基,推荐初始工作浓度为 10µM。对不同的细胞或处理,DCFH-DA 工作浓度 可为 100 nM-20µM,需要进行预实验确定合适的浓度,总体稀释倍数应在1:500-1:1000以上,避免DMSO对细胞 的影响。
②、37℃孵育细胞30min-几小时,通常为30min-60min。
③、细胞收集:
悬浮细胞:1000g离心5-10min收集细胞,用PBS洗涤1-2次,离心收集细胞沉淀物用于荧光检测。
贴壁细胞:用胰酶消化细胞(0.25%胰酶消化2-3min),加入培养基终止消化,制成细胞悬浮,1000g离心5- 10min收集细胞,用PBS洗涤1-2次,离心收集细胞沉淀物用于荧光检测。
(2)荧光检测
①、将收集好的细胞用PBS进行重悬,并检测。
②、波长设置:最佳激发波长为500、485(500±15nm),最佳发射波长525(530±20nm)。
2 . 组织样本的测定:(可用于荧光酶标仪以及荧光分光光度计法测定)
(1)样本前处理:
称取组织重量,按照重量(g):体积(ml)=1:20的比例加入匀浆介质(10mM磷酸缓冲液)进行匀浆,之后 1000g离心10min,取上清液待测,取部分上清液用于蛋白的测定。

(2)加入荧光探针:操作表格如下:

用移液枪吹打混匀,37℃避光孵育30min。
(3)荧光检测
①、波长设置:最佳激发波长为500、485(500±15nm),最佳发射波长525(530±20nm), 测定其荧光强度。
②、测定结果以荧光强度/毫克蛋白表示。

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