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产品概述

染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)作为最佳的研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法,它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。


操作流程

1. 每皿细胞(9ml 培养液),加入243µl 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%,室温摇床10min。

2. 终止交联:加1M 甘氨酸1.26ml,使其终浓度为0.125M,室温摇床5min。

3. 吸尽培养基,用预冷的PBS洗两次后,加适量蛋白酶抑制剂(2ml PBS中加入5µl 蛋白酶抑制剂),用细胞刮收集细胞,2000rpm,4℃离心5min。
4. 弃上清,加入1ml Buffer A,冰上放置10min,3000-5000rpm离心5min。
5. 弃上清,加入400µl Buffer B(每100µl Buffer B中含有10 6细胞)重悬后加入5µl 蛋白酶抑制剂。
6. 超声破碎。一般来说,300W超声10s,间隔30s,12次。12000rpm,4℃离心20min。取20µl上清电泳检测,抹带集中在500-1000bp左右即可。
7. 样品分成三组,每组100µl ,A:实验组 ; B:阳性对照组 ; C:阴性对照组,剩余样品可放置-80℃保存。
8. 在三组样品中分别加入900 µl  Chip Diluiton Buffer。
9. 准备ProteinA beads,用1ml PBS 清洗三次(3000rpm离心1min)后保存备用,此步可提前准备。
10. 三组样品中各加入60 µl ProteinA beads, 4℃颠倒混匀1-2h。
11. 混匀后4℃静置10min,3000rpm离心1min。
12. 取上清,每组样品取20µl 进行 Input实验,-20℃保存。
13. 实验组中加入1-10µg 抗体;阳性对照组加入1µg RNA Polymerase II抗体;阴性对照组加入1µg 正常血清IgG,4℃过夜孵育。
14. 三组样品中再加入60µl ProteinA beads, 4℃颠倒混匀1-2h。
15.洗涤ProteinA beads 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗步骤为:加入1ml 预冷溶液,在4℃混匀10min,3000rpm离心1min,除去上清。
a. Low Salt Wash Buffer,1次。
b. High Salt Wash Buffer,1次。
c. LiCl Wash Buffer,1次。
d. TE Buffer,2次。
16. 每管加入100µl Elution Buffer(100 µl10%SDS+100µl 1M NaHCO3+800µl ddH2O),室温颠转10min后3000rpm离心1min,收集上清。重复洗脱1次,终体积200µl 。
17. 取出Input实验样品,室温融化后加入180µl Elution Buffer。
18. 解交联。每管中加入8µl 5M NaCl,混匀,65℃解交联过夜。
19. 解交联结束后,每管加入1µl RNaseA,37℃孵育1h。
20. 每管加入4µl 0.5M EDTA,8µl 1M Tris-HCl(PH=6.5),1µl Proteinase K,45℃孵育2h。

21. DNA片段回收(WLA052a DNA凝胶回收试剂盒)。

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