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产品概述

凝胶迁移实验又称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验(EMSA,electrophoretic mobility shift assay),是一种用于蛋白与核酸相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验,也可应用于蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究,通过EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的结合情况,从而可以研究细胞内一些转录因子的激活水平。 本试剂盒中结合缓冲液(10X)中含有poly(dI-dC)等有效成分。其中poly(dI-dC)的浓度经过优化,可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合,同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。 本试剂盒提供了进行EMSA实验除探针外的所有试剂,使EMSA实验变得简单方便。


操作流程

1. 探针退火。用TE缓冲液稀释引物,结合反应前等体积混合两条引物(生物素标记、非生物素标记以及非生物标记的突变探针),94℃退火引物 , 并自然冷却至4℃,待用。
2. 核蛋白提取。请使用万类生物核蛋白和浆蛋白提取试剂盒(WLA020a)具体提取过程请参考说明书。
3. 制备凝胶、电泳。

(1)制备6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶:(注意根据试剂情况按比例调整总体积)。


(2)预电泳。以预冷为4℃的0.5XTBE为电泳缓冲液,100V预电泳30-60min。
4. 形成探针-蛋白复合物.


按照上述顺序依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温放置10min,从而消除可能发生的探针与蛋白的特异性结合,或者让冷探针优先反应。之后加入标记好的探针,混匀,室温避光放置20-30min。
5. 电泳。加入5X上样缓冲液 5ul混匀,上样10-20ul,100V电泳至溴酚蓝于三分之二处。
6. 转膜。
(1)在预冷的0.5XTBE中浸泡凝胶,尼龙膜,滤纸和纤维垫。
(2)按以下顺序制作“三明治”:纤维垫,滤纸,凝胶,尼龙膜,滤纸,纤维垫。确保凝胶位于阴极,膜位于阳极。
(3)在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上进行,300mA,40min。
7. 交联。转膜后,贴近胶的尼龙膜一面在紫外线下照射30min。
8. 封闭。交联后,加入15ml 封闭液 封闭30min。
9. 孵育。将HRP标记Streptavidin以1:5000稀释于12ml 封闭液中,摇床室温缓慢摇晃孵育20min。
10. 洗膜。
25ml 洗涤液Ⅰ 洗膜5min →25ml 洗涤液Ⅱ 洗膜15min →25ml 洗涤液 Ⅲ 洗膜5min,2次 →25ml 0.1%SDS in 2X检测平衡液 洗膜5min,2次→25ml 0.1%SDS in 1X检测平衡液 洗膜10min,2次 →25 ml 0.1%SDS in 0.5X检测平衡液 洗膜5min,2次。
11. ECL发光检测信号。

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