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产品概述

Hoechst 33258,也称bisBenzimide H33258,它是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料,对细胞的毒性较低。Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33258染色液可直接用于固定细胞或组织的细胞核染色,也可直接用于活细胞或组织的细胞核染色。 Hoechst 33258的最大激发波长为346nm,最大发射波长为460nm;Hoechst 33258和双链DNA结合后,最大激发波长为352nm, 最大发射波长为461nm。封片后在荧光显微镜下观察细胞凋亡时,会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染。


操作流程

1. 对于固定的细胞或组织:

(1) 贴壁细胞
a. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5min或更长时间,用细胞培养基PBS或0.9%NaCl洗涤3遍,再用细胞培养液洗涤1遍。将盖玻片置于6孔板内,种入细胞培养过夜,使约为50%-80%满。
b. 刺激细胞发生凋亡后,吸尽培养液,加入0.5ml固定液,固定10min或4℃过夜。
c. 去固定液,用 PBS或0.9%NaCl洗涤2遍,每次3min,吸尽液体。
d. 加入0.5mlHoechst 33258染色液,染色5min。也宜用摇床,或手动晃动数次。
e. 用PBS或0.9%NaCl洗涤2遍,每次3min,之后用抗淬灭封片液封片。
(2)悬浮细胞
a. 离心收集细胞样本于1.5ml离心管内,加入0.5ml固定液,缓缓悬起细胞,固定10min或4℃过夜。
b. 离心去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗涤2遍,每次3min。
c. 离心后吸去大部分液体保留约50μl液体,再缓缓悬起细胞,滴加至载玻片上,尽量使细胞分布均匀。
d. 稍晾干,使细胞贴在载玻片上不易随液体流动,均匀滴上0.5mlHoechst 33258染色液,染色5min。用吸水纸从边缘吸去液体,微晾干。
e. 用PBS或0.9%NaCl洗涤2遍,每次3min,之后用抗淬灭封片液封片。
(3)组织切片
对于任何常见切片,处理至常规可以进行免疫染色时,或完成常规的免疫染色后,用PBS或0.9%NaCl洗涤2遍,每次3min,即可进行后续的Hoechst 33258染色,染色5-10min,用PBS或0.9%NaCl洗涤2遍,每次3min,之后用抗淬灭封片液封片。
2. 对于活细胞或组织:
a. 加入适当量Hoechst 33258染色液,必须充分覆盖住待染色的样品,通常对于六孔板一个孔需加入1ml染色液,对于96孔板一个孔 需加入100μl染色液。
b. 在适宜于细胞培养的温度培养20-30min。弃染色液,用PBS或培养液洗涤2-3次即可进行荧光检测。

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