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产品概述

Annexin V是一种分子量为35kDa的Ca 2+依赖性磷脂结合蛋白,能够特异性结合磷酯酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)。磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧,当细胞发生凋亡时,细胞会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面,即细胞膜外侧。FITC标记的Annexin V探针,即Annexin V-FITC,能够特异性的结合这些外翻的磷酯酰丝氨酸,通过流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到细胞发生凋亡的情况。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI),是一种核酸染料,它不能通过正常细胞膜,当细胞处于坏死或凋亡中晚期状态下,细胞丧失膜完整性,碘化丙啶进入细胞内部,与细胞核内的核酸发生结合,通过流式细胞仪或荧光显微镜检测,反映细胞膜完整状态的信息。故将Annexin V-FITC与PI联合使用,将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。


操作流程

对于流式细胞仪检测:

1.悬浮细胞直接离心(1500rpm,5min)收集;贴壁细胞用胰蛋白酶(可含EDTA)消化,消化时间不宜过长,加入完全培养基终止反应;

2.PBS漂洗细胞两次,并进行细胞计数,离心(1500rpm,5min)收集1-5×10 5个细胞;

3.加入500μl Binding buffer重悬细胞;

4.加入5μl Annexin V-FITC混匀后,加入10μl Propidium Iodide混匀,室温避光反应5-15min;

5.请在1h内用流式细胞仪检测,Annexin V-FITC荧光信号通过FL1通道检测,Propidium Iodide荧光信号通过FL2或FL3通道检测;

6.每次检测需要同时检测Annexin V-FITC单阳性管、Propidium Iodide(PI)单阳性管,用于确定荧光补偿数值及十字象限门的位置。

对于荧光显微镜原位观察:

7.对于悬浮细胞,可将步骤4所得细胞直接涂片进行荧光显微镜观察;

8.对于贴壁细胞,可将细胞接种于24/48/96孔细胞培养板内,凋亡处理结束后,用PBS漂洗两遍;

9.加入配好的凋亡染色液(250μl Binding buffer,5-10μl Annexin V-FITC,10μl Propidium Iodide,混匀)室温避光孵育15min , 24/48/96孔 细胞培养板各需250/100/50μl上述染液,随即进行荧光显微镜观察;

10.Annexin V-FITC激发波长488nm,发射波长530nm呈绿色荧光 ; Propidium Iodide激发波长488nm , 发射波长630nm呈红色荧光。

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